做單細胞測序、流式細胞術或者細胞培養的都知道，真正決定實驗質量的不是測序平臺，也不是分析軟件，而是前面的樣品前處理制備。不少實驗人員都有過類似經歷：組織解離完成后，細胞數量不少，但活率偏低；或者細胞團塊很多，過濾時堵篩網；再或者流式檢測背景高、數據離散。很多時候，并不是后續實驗出了問題，而是單細胞懸液制備階段沒有處理好。

　　單細胞懸液制備看起來只是把組織分散成單個細胞，實際上每一步都會影響到最終的實驗結果。下面結合實驗室的常見操作，總結幾個容易忽略卻非常關鍵的細節。

　　一、組織離體后盡快處理

　　組織樣本離體以后，細胞活性會隨著時間逐漸下降。尤其是腫瘤組織、腦組織、脾臟等活性較高的樣品，如果長時間放置在室溫環境中，很容易出現細胞凋亡增加、RNA降解等情況。

　　比較穩妥的方法，是樣本取出后立即放入預冷保存液中，并盡快進入解離流程。如果需要運輸，也建議全程低溫保存，盡量縮短等待時間。

　　二、組織剪切大小要均勻

　　不少人認為有了單細胞懸液制備儀解離設備，就可以直接放整塊組織進去。其實并不是這樣。如果組織塊太大，消化酶很難快速滲透到內部，容易出現外層已經解離，而中心仍然保持完整的情況。

　　一般建議將組織剪切成2～3毫米左右的小塊，大小盡量保持一致，這樣酶解效率更均勻，也能減少后續機械解離的壓力。

　　三、不要一味延長酶解時間

　　很多實驗失敗后，第一反應就是是不是酶解時間太短？實際上，時間過長同樣會影響實驗。酶解不足，組織無法分散。酶解過度，則可能破壞細胞膜，降低細胞活率，甚至影響細胞表面抗原表達，對于后續流式檢測尤其不利。

　　因此，不同組織應根據特點選擇對應的酶種類、濃度和消化時間，不建議簡單照搬其他實驗方案。

　　四、機械吹打力度要適中

　　組織經過酶解后，很多人會反復用移液槍吹打，希望盡快得到更多單細胞。其實吹打次數越多，并不代表效果越好。力度過大容易造成細胞破裂，特別是免疫細胞、神經細胞等較脆弱的細胞，更容易受到機械損傷。

　　建議采用寬口槍頭緩慢吹打，根據組織解離程度適當調整次數，不要為了追求數量而影響細胞質量。

　　五、過濾步驟不能省

　　解離結束后，一定要經過細胞濾網過濾。很多實驗人員覺得樣品已經比較均勻，就直接離心。實際上，沒有解離好的組織碎塊、纖維以及細胞團塊都會影響后續實驗。尤其是在流式細胞術或單細胞測序過程中，大顆粒組織容易堵塞儀器，也會增加雙細胞比例。一般根據實驗需求選擇濾網，可以有效去除雜質，提高單細胞純度。

　　六、離心參數不要盲目提高

　　有時候為了讓細胞沉降更好，有人會提高離心速度。這種做法并不推薦。不同細胞對離心力的耐受程度不同，速度過高可能造成細胞損傷，尤其是一些原代細胞和免疫細胞。建議按照實驗方案設置合適的離心速度和時間，既保證細胞回收率，又盡量減少機械損傷。

　　七、全程注意溫度控制

　　很多組織樣品對溫度變化比較敏感。除酶解階段需要恒溫外，其余步驟通常建議保持低溫操作。例如PBS、培養基提前預冷，離心結束后及時放回冰上，減少細胞代謝，提高活率。對于需要開展單細胞RNA測序的實驗來說，這一點特別重要。

　　八、減少人為操作差異

　　實驗室中，同一個樣品由不同人員處理，得到的結果有時差異明顯。原因就在于每個人剪切方式、吹打力度、混勻速度都不同。現在也有越來越多實驗室開始使用單細胞懸液制備儀，就是希望將組織解離流程標準化。

　　單細胞懸液制備儀自動化解離設備能夠按照設定程序完成恒溫酶解、機械解離等步驟，減少人工操作帶來的誤差，對于批量樣品處理和多中心實驗尤為有幫助。

　　九、及時檢測細胞活率

　　制備完成后，不建議直接進入下游實驗。最好先進行細胞計數和活率檢測。如果發現活率偏低、碎片較多或細胞團塊明顯，應先分析原因，再決定是否繼續實驗。這一小步雖然增加了一點時間，卻能夠避免后續測序、流式等實驗失敗帶來的更大損失。

　　如何提高制備的單細胞懸液質量？

　　綜合來看，高質量單細胞懸液通常具備幾個特點：

　　1. 細胞分散均勻，沒有明顯團聚；

　　2. 活率較高，細胞膜完整；

　　3. 雜質和組織碎片較少；

　　4. 細胞濃度符合后續實驗要求；

　　5. 重復實驗結果穩定。

　　想達到這些目標，并不是依賴某一個步驟，而是整個前處理流程共同決定。從組織取材、低溫保存、組織剪切，到酶解、機械解離、過濾、離心，每一步都需要規范操作。

　　很多人認為，單細胞實驗真正難的是數據分析。實際上，前處理才是決定實驗成敗的重要環節。一份質量穩定的單細胞懸液，不僅能夠提高細胞活率和回收率，也能為流式細胞分析、單細胞測序、細胞培養等實驗提供可靠基礎。

　　對于樣本數量較多、實驗重復性要求較高的科研團隊來說，建立規范的單細胞懸液制備流程，并結合自動化單細胞懸液制備設備完成標準化操作，不僅能夠減少人為誤差，還能提升整體實驗效率。